最低吸附二抗 Cross-adsorbed (min X) secondary antibody

不同物種的免疫球蛋白具有相似的結構。針對一個物種產生的二抗很可能透過那些共同的結構，來識別其他物種免疫球蛋白上的抗原決定位 (epitope)。這種交叉反應可能導致背景組織染色或來自非目標一抗的訊號。當實驗需要使用多個物種的抗體時，與非目標物種抗體具有最小交叉反應性 (min X) 的二抗，則是免疫染色中不可或缺的部分。
 

• 何謂交叉反應 (cross-reactivity) ？

交叉反應描述一個二抗與非預期目標的結合。當不同物種的免疫球蛋白具有相同或相似的序列以及相似的四級結構時，就會發生物種的交叉反應。辨認一個物種的免疫球蛋白的抗體互補位 (paratope) (又稱為抗原結合位, antigen-binding site) 可能偵測到來自另一個物種免疫球蛋白上的同源表位 (homologous epitope)。這在小鼠和大鼠等近親物種中很常見，但也可能出現在不太明顯的配對中。

交叉反應有可能偵測到樣品中的內生性免疫球蛋白 (背景訊號) 及/或 在多染實驗中檢測到其他的實驗抗體 (脫靶訊號, off target effect)。
 

• 何謂交叉吸附 (cross-adsorption)？

親和純化的抗體透過與固定在固相凝膠上的目標蛋白結合，從抗血清中分離出來。交叉吸附過的二抗再進一步純化，以去除那些恰好可辨別其他蛋白上有共享抗原表位的抗體。根據抗體的描述，用於交叉吸附的凝膠可能含有來自於不同物種、不同小鼠 IgG 亞型 (subtype) 或不同抗體片段的蛋白質。 Jackson 透過 ELISA 及 IEP (immunoelectrophoresis) 測試，確認已大幅度地降低了物種的交叉反應。
具有最小交叉反應的二抗可用於含有內生性免疫球蛋白 (Ig) 之樣品染色，用以降低背景染色，例如 Mouse Anti-Rat IgG (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs, Ms, Gt, Rb Sr Prot) 在小鼠組織上檢測大鼠一抗時，可將背景降至最低。

描述中帶有 (min X ... Sr Prot) 的抗體表示已針對括號中所示物種的 IgG 和/或血清蛋白進行吸附及/或測試。例如，Alexa Fluor® 488 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov、Ck、Gt、GP、Sy Hms、Hrs、Hu、Rb、Rat、Shp Sr Prot) 表示已使用 牛、雞、山羊、天竺鼠、敘利亞倉鼠、馬、人類、兔、大鼠 及 綿羊等 IgG 及血清蛋白吸附處理。交叉吸附抗體與這些物種表現出最小的交叉反應，無論是實驗使用的抗體或樣品中的內生性蛋白質。

括號內使用下列之縮寫：

 

• 實驗是否需要交叉吸附的二抗體？

許多免疫技術需要檢測系統中來自多個物種的抗體，無論是 ELISA、流式細胞儀或 IHC。建議使用交叉吸附的二抗，以避免檢測到非預期目標的免疫球蛋白。

對於物種的交叉反應並非主要考量的實驗，可以選擇使用交叉吸附抗體。額外純化的步驟使高度交叉吸附的抗體更加昂貴，也是需要考慮的因素。此外，使用廣泛交叉吸附或針對密切相關物種吸附的抗體，可能會導致訊號減弱，因為針對預期目標的抗體數量減少。

多重染色範例：

Sample	Mouse	Mouse	Mouse
Antigen	Antigen A	Antigen B	Antigen C
Blocking Step	Step 1	Step 4	Step 7
	5% Normal Donkey serum to block	5% Normal Donkey serum to block (if needed)	5% Normal Donkey serum to block (if needed)
	Wash	Wash	Wash
Primary Antibody Step	Step 2	Step 5	Step 8
	Goat Anti-Antigen A	Rabbit Anti-Antigen B	Rat Anti-Antigen C
	Wash	Wash	Wash
Secondary Antibody Step	Step 3	Step 6	Step 9
	Probe 1 Donkey Anti-Goat IgG (H+L)   (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms,  Rb, Rat Sr Prot)	Probe 2 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Probe 3 Donkey Anti-Rat IgG (H+L)  (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs,  Hrs, Hu, Ms, Rb, Shp Sr Prot)

在此例中，所使用的二抗體皆無法互相辨認，因其都是由驢子(Donkey)產生的，且經過另外兩個物種的最小吸附處理，因此無法辨認步驟 2、5 和 8 中使用的其他一抗 (稱為 min X )。此外，這些二抗也經過小鼠 (Mouse, Ms) 之吸附處理，因此不會與小鼠組織中可能存在的內生性免疫球蛋白 (Ig) 發生反應。
注意：請勿使用正常血清稀釋任何抗體，或將抗體混合在一起以節省時間，因為這可能會導致免疫複合物形成以及增加背景訊號。

• 相近物種 

考慮針對密切相關物種吸附的抗體時應謹慎，因為最低吸附處理大大降低了抗原表位的辨別率，並且可能會對某些單株抗體辨別率較差。

例如，選擇經 anti-mouse IgG 吸附過的 rat IgG 在含有內源性免疫球蛋白的大鼠組織中辨認小鼠一抗，或在多重染色實驗中包含大鼠一抗。然而，在缺乏大鼠的免疫球蛋白的情況下，偵測測小鼠一抗時，不需對大鼠 IgG 進行交叉吸附。

另外兩個與相近物種吸附後，抗原決定位 (epitope) 辨識能力減弱的抗體例子為 Anti-Rat IgG (min X ... Mouse ... Sr Prot) 及 Anti-Armenian Hamster IgG (min X ... Mouse, Rat ... Sr Prot).。
 

• 其他實驗考慮因素 

1. 一抗：一抗必須針對其目標蛋白具有特異性，以避免脫靶訊號，因為二抗無論與一抗結合在哪裡，都會檢測到一抗。一個不含一抗的實驗控制組，可確認一抗或二抗是否為非特異性訊號的來源。 

2. 設備：在多重染色中，明顯的脫靶 (Off-target) 訊號可能是由於不適當的激發/發射濾片 (Excitation/Emission filter) 的結果。具有寬激發/發射光譜的螢光團結合物 (fluorophore conjugate) 可在另一個通道中發出訊號，故使用窄帶通發射濾片 (narrow bandpass emission filter) 有助於區別來自多個螢光團的訊號。

3. 實驗設計：驗證每個實驗中使用的每對抗體非常重要。在進行多重染色之前，先對每組一抗和二抗進行滴定。透過按照順序的使用試劑，而非混合試劑，可減少蛋白質-蛋白質間的相互作用。
親和純化之IgG抗體選擇 (Whole IgG Affinity-Purified Antibodies)