ELISPOT 採用三明治酵素連結免疫吸附試驗 (Sandwich ELISA) 原理，將針對目標分析物的單株或多株抗體預先被覆於 PVDF 背襯的微孔盤上。將適當刺激的細胞加入孔洞中，並將微孔盤置於 37 °C、CO₂ 的加濕培養箱中培養特定的一段時間。在此培養期間，固定的抗體會與附近細胞上分泌的分析物 (蛋白質) 結合。

洗去細胞和未結合的物質後，於孔洞中加入針對目標分析物並以生物素 (biotin) 標記的多株抗體。再次清洗以去除未結合的生物素標記抗體後，加入鏈黴親和素 (streptavidin) 標記的鹼性磷酸酶 (alkaline-phosphatase, AP)。隨後透過清洗，去除未結合的酵素，並加入酵素的受質溶液 (BCIP/NBT)。在分泌細胞激素的部位會形成藍黑色沉澱物，呈現為斑點狀，每個斑點代表一個分泌分析物的細胞。可以使用自動 ELISPOT 讀盤機來計數這些斑點，也可以使用立體顯微鏡手動計算。