1. 細菌和真菌檢測
為了評估細胞株中是否受到細菌和真菌的污染,會將細胞分散到針對細菌和真菌優化的三種培養基中,儘管培養條件涵蓋了大多數細菌和真菌,但在以下條件,可能無法檢測到一些特定條件的微生物。
*培養基--含有 5% 兔血的血液培養基
含有 2% 酵母萃取物的營養肉湯(NB 培養基)
硫代乙醇酸鹽肉湯(TGC 培養基)
*培養溫度:35℃
*培養期:1週-2個月(取決於培養基)
2. 黴漿菌檢測
細胞若遭受黴漿菌污染是一個嚴重的問題,可能導致錯誤的數據以及一連串不必要的重複實驗。因此JCRB透過以下三種常規性檢測方法來檢測細胞株是否受黴漿菌汙染
A、黴漿菌活性:透過黴漿菌檢測試劑來驗證是否細胞遭受汙染
*Reagent:MycoAlert™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, LT07-318)
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B、利用Vero細胞株進行螢光染色
將待測細胞株的培養上清液加入Vero細胞(JCRB0111)中進行螢光染色,培養5 天後,以Hoechst 33258 染色,若細胞遭受黴漿菌汙染,則在細胞核周圍會觀察到呈現蜘蛛網狀螢光(如下所示),也可透過這種方法觀察到細菌和真菌的污染。
C、Nested-PCR
使用兩組黴漿菌核酸放大的引子進行檢測,以提高了靈敏度和特異性。
*當細胞被黴漿菌污染時,可用MC-210 (DS Pharma Biomedical) 去除,並進行三個月的培育,已確保黴 漿菌完全除掉 。如MC-210 無效,也可參考這二種藥物:Plasmocin (InvivoGen) 或 Plasmocure (InvivoGen)
3. 細胞系鑑定
人類細胞株依據 Short Tandem Repeat (STR) 進行鑑定
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A list of cross-contaminated or misidentified cell lines
*試劑參考:PowerPlex®16 System (Promega, DC6530)
4. 病毒檢查
透過10種 DNA 病毒和 6 種 RNA 病毒的核酸片段來檢測人類細胞株。
*2006年以前的細胞株並未全部檢測,仍持續進行中
使用的萃取試劑:AllPrep DNA/RNA mini kit
DNA的檢測方法: Real-time TaqMan PCR assay (positive control:GAPDH)
Target viruses:CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, BKV, JCV, ADV,B19V (parvoB19), HBV, HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, HAV
RNA的檢測方法: Real-time TaqMan RT-PCR assay (positive control:β-actin)
Target viruses:HCV, HTLV-1, HIV-1, HTLV-2, HIV-2, HAV
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5. 物種鑑定
動物細胞株利用isozyme來鑑定其物種,該項分析持續進行至2016年,但因該產品停產,而無法持續進行鑑定
6. 染色體分析
染色體數量是根據吉姆薩染色( Giemsa-stained )的中期細胞計數的,利用此染色法來辨別異質群
體中細胞之間的差異。透過 G 序列的核型分析,可辨識每個細胞株中的特殊染色體排列特徵。